6.3 Enzymkinetikk

a) Hastigheten ved 12 mM.

Oppsett: $K_m = 4{,}0\,\text{mM}$, $V_{\max} = 80\,\mu\text{mol}\,\text{L}^{-1}\,\text{min}^{-1}$, $[S] = 12\,\text{mM}$. Km og $[S]$ har allerede samme enhet, så ingen konvertering er nødvendig.

Innsetting:

$$V_0 = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_m + [S]} = \frac{80 \cdot 12}{4{,}0 + 12}$$

Mellomregning:

$$V_0 = \frac{960}{16} = 60$$

Svar med enhet: $V_0 = 60\,\mu\text{mol}\,\text{L}^{-1}\,\text{min}^{-1}$.

Tolkning i klartekst: dette er $60/80 = 0{,}75$, altså 75 prosent av Vmax. Ved en substratkonsentrasjon på tre ganger Km arbeider enzymet på tre firedeler av full fart — vi er godt oppe på kurven, men ikke ved metning.

b) Konsentrasjonen som gir 90 prosent av Vmax.

Oppsett: vi skal finne $[S]$ når $V_0 = 0{,}90\,V_{\max}$. Sett inn og forkort bort $V_{\max}$:

$$0{,}90 = \frac{[S]}{K_m + [S]}$$

Mellomregning:

$$0{,}90\,(K_m + [S]) = [S] \;\Longrightarrow\; 0{,}90\,K_m = 0{,}10\,[S] \;\Longrightarrow\; [S] = 9K_m$$

$$[S] = 9 \cdot 4{,}0\,\text{mM} = 36\,\text{mM}$$

Kontrollregning:

$$V_0 = \frac{80 \cdot 36}{4{,}0 + 36} = \frac{2880}{40} = 72 = 0{,}90 \cdot 80 \quad \checkmark$$

Svar med enhet: $[S] = 36\,\text{mM}$.

Tolkning i klartekst: for å gå fra halv fart (som nås ved 4,0 mM) til 90 prosent av full fart, må konsentrasjonen nidobles. Kurven flater altså ut raskt, og det er tungt å presse et enzym helt opp mot Vmax.

---

Slik ville sensor telt momentene (4 vekttall):

- Må-punkter: riktig likning satt opp; riktig innsetting med tall; riktig svar med enhet i a).
- Pluss-punkter: tolkningen som prosent av Vmax; utledningen $[S] = 9K_m$ i stedet for prøving og feiling; kontrollregningen.
- Feller: å oppgi svaret uten enhet, eller med feil enhet — Km har konsentrasjonsenhet, $V_0$ har hastighetsenhet, og de skal ikke blandes; felle E22 — å oppgi sluttsvaret uten vist utregning.
- Merk hvor billig full pott er: to innsettinger og en tolkningssetning. Regneoppgaven i oppgave F er den mest forutsigbare poenghøstingen i settet.

Trinn 1 — regn om til dobbeltresiproke verdier:

Trinn 5 — regn $K_m$:

$$K_m = a \cdot V_{\max} = 0{,}0200 \cdot 100 = 2{,}00\,\text{mM}$$

Trinn 6 — kontroller med et punkt som ikke ble brukt i utregningen, for eksempel $[S] = 8\,\text{mM}$:

$$V_0 = \frac{100 \cdot 8}{2{,}00 + 8} = \frac{800}{10} = 80{,}0 \quad \checkmark$$

Dette stemmer nøyaktig med målingen i tabellen.

Svar med enhet: $V_{\max} = 100\,\mu\text{mol}\,\text{L}^{-1}\,\text{min}^{-1}$ og $K_m = 2{,}00\,\text{mM}$.

Tolkning i klartekst: enzymet når halv fart allerede ved 2,0 mM substrat. Ved den høyeste konsentrasjonen i tabellen, 16 mM, er hastigheten 88,9 — altså nærmer den seg taket på 100, men er ikke framme. Det er nettopp derfor Km og Vmax må leses av fra et plott og ikke bare gjettes fra den høyeste målingen.

---

Slik ville sensor telt momentene (6 vekttall):

- Må-punkter: riktig omregning til $1/[S]$ og $1/V_0$; riktig stigningstall; riktig y-skjæring; riktig Vmax og Km med enhet. Fem momenter, verdt omtrent fem av de seks poengene.

- Pluss-punkter: kontrollregningen; tolkningen av at 16 mM ikke er metning; at Km oppgis med konsentrasjonsenhet uten at det påpekes særskilt — altså at du bare gjør det riktig.

- Feller: å bruke $K_m = 1/a$ i stedet for $K_m = a \cdot V_{\max}$; å lese den høyeste målte hastigheten som Vmax; å oppgi Km i hastighetsenhet; felle E22 — sluttsvar uten vist utregning.

- Merk hvorfor kontrollregningen er verdt tiden: den tar femten sekunder og avslører nesten enhver regnefeil. Den er dessuten et moment i seg selv.

a) Bestemmelse av hemmertypene.

Trinn 1 — dobbeltresiproke verdier:

$$V_{\max} = \frac{1}{0{,}0100} = 100, \qquad K_m = 0{,}0600 \cdot 100 = 6{,}00\,\text{mM}$$

Med hemmer B:

$$a = \frac{0{,}0600 - 0{,}0400}{1{,}000 - 0{,}500} = 0{,}0400, \qquad b = 0{,}0400 - 0{,}0400 \cdot 0{,}500 = 0{,}0200$$

$$V_{\max} = \frac{1}{0{,}0200} = 50{,}0, \qquad K_m = 0{,}0400 \cdot 50{,}0 = 2{,}00\,\text{mM}$$

Trinn 3 — sammenligning:

Konklusjon:

- Hemmer A er kompetitiv. $K_m$ er tredoblet, fra 2,00 til 6,00 mM, mens $V_{\max}$ står uendret på 100.

- Hemmer B er ikke-kompetitiv. $V_{\max}$ er halvert, fra 100 til 50,0, mens $K_m$ står uendret på 2,00 mM.

— naturlig pausepunkt —

b) Mekanismene.

Kompetitiv (A): hemmeren ligner substratet og binder seg til det aktive setet. Substrat og hemmer konkurrerer om den samme plassen, og bare én av dem kan sitte der om gangen. Derfor må det mer substrat til for å nå halv fart — Km stiger. Men taket er uendret, fordi et stort nok substratoverskudd fortrenger hemmeren fullstendig.
Ikke-kompetitiv (B): hemmeren binder seg et annet sted enn det aktive setet og endrer enzymets form slik at det arbeider dårligere. Hemmer og substrat kan sitte på enzymet samtidig. En del av enzymmolekylene er dermed satt ut av spill uansett hvor mye substrat som er til stede — Vmax synker. De molekylene som fortsatt virker, binder substratet like godt som før, så Km er uendret.
c) Bare den kompetitive (A) kan overvinnes med mer substrat.
Begrunnelse: kompetitiv hemming er en konkurranse om den samme plassen. Øker du substratkonsentrasjonen nok, vinner substratet konkurransen, og hastigheten nærmer seg det uhemmede Vmax. Det er nettopp derfor Vmax er uendret.
Ikke-kompetitiv hemming er ingen konkurranse: hemmeren sitter et annet sted, og substratmengden endrer ikke forholdet mellom dem. Uansett hvor mye substrat du tilsetter, blir en fast andel av enzymmolekylene værende hemmet, og Vmax forblir halvert.

Kontrollregning som bekrefter tolkningen — sett inn $[S] = 16$ mM for hemmer B:

$$V_0 = \frac{50{,}0 \cdot 16}{2{,}00 + 16} = \frac{800}{18} = 44{,}4 \quad \checkmark$$
Selv ved 16 mM, altså åtte ganger Km, ligger hastigheten på 44,4 og nærmer seg 50 — ikke 100. Hemmingen lar seg ikke kjøre bort.

---

Slik ville sensor telt momentene (12 vekttall):

- Må-punkter: riktig omregning til dobbeltresiproke verdier; riktig Km og Vmax for alle tre seriene; riktig type for A og for B, begrunnet med tallene. Til sammen omtrent åtte av de tolv poengene.

- Pluss-punkter: mekanismeforklaringene i b) med at hemmer og substrat konkurrerer eller ikke gjør det; svaret i c) med begrunnelsen knyttet tilbake til at Vmax er uendret; kontrollregningen.

- Feller: felle E17 — å bytte om de to typene. Den er den vanligste, og huskeregelen som holder, er at kompetitiv kan overvinnes, og at uendret tak derfor betyr kompetitiv. Videre: å konkludere med type uten å oppgi tallene (halve uttellingen); å oppgi Km uten enhet; felle E22 — sluttsvar uten vist utregning.

- Tidsbruk: 12 poeng av 100 over seks timer svarer til rundt 43 minutter. Regnearbeidet over tar femten–tjue minutter for hånd, og tabellene er det som tar tid. Resten er lesing og gjennomlesing.

---

Til sammenligning: en besvarelse som er bestått på marginen

«Hemmer A er kompetitiv fordi Vmax er den samme. Hemmer B er > ikke-kompetitiv fordi Vmax har gått ned til halvparten. Kompetitive > hemmere sitter i det aktive setet, og de kan konkurreres bort med mer > substrat.»

Hva som er bra nok her: begge typene er riktig bestemt, kriteriet (Vmax uendret mot Vmax redusert) er riktig brukt, og mekanismen for den kompetitive er med. Det er nok til uttelling på de viktigste må-punktene, og besvarelsen er over streken.

Hva som mangler: hele utregningen. Km-verdiene er ikke oppgitt for noen av seriene, så påstandene hviler på et blikk framfor på tall — og det er nettopp felle E22. Mekanismen for den ikke-kompetitive er ikke forklart. Denne besvarelsen lander rundt fem av tolv: bestått på marginen, men den lar mer enn halvparten av poengene ligge, og alt som mangler, var regnearbeid den hadde rukket.

a) Katalytisk effektivitet.

Enhetskonvertering først — formelen krever Km i M, og verdiene er oppgitt i mM:

$$0{,}10\,\text{mM} = 0{,}10 \cdot 10^{-3}\,\text{M} = 1{,}0 \cdot 10^{-4}\,\text{M}$$

$$5{,}0\,\text{mM} = 5{,}0 \cdot 10^{-3}\,\text{M}$$

Enzym A:

$$\frac{k_{\text{cat}}}{K_m} = \frac{500\,\text{s}^{-1}}{1{,}0 \cdot 10^{-4}\,\text{M}} = 5{,}0 \cdot 10^{6}\,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$$

Enzym B:

$$\frac{k_{\text{cat}}}{K_m} = \frac{2000\,\text{s}^{-1}}{5{,}0 \cdot 10^{-3}\,\text{M}} = 4{,}0 \cdot 10^{5}\,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$$

b) Enzym A arbeider best når substratet er knapt.

Effektiviteten er $5{,}0 \cdot 10^{6}$ mot $4{,}0 \cdot 10^{5}$ — altså mer enn ti ganger så høy, selv om enzym B har fire ganger så høy $k_{\text{cat}}$.

Begrunnelsen: enzym B er raskest når det er mettet, men det krever 50 ganger så mye substrat for å komme opp i halv fart (Km 5,0 mot 0,10 mM). Ved lave substratkonsentrasjoner — som er situasjonen i en levende celle — teller den lave Km-en langt mer enn den høye $k_{\text{cat}}$-en.

Poenget: «raskest» og «mest effektivt» er ikke det samme. Hvilket som gjelder, avhenger av hvor mye substrat som er til stede.

c) $k_{\text{cat}}$ for det tredje enzymet.

$$k_{\text{cat}} = \frac{V_{\max}}{[E]_T} = \frac{100\,\mu\text{mol}\,\text{L}^{-1}\,\text{min}^{-1}}{0{,}50\,\mu\text{mol}\,\text{L}^{-1}} = 200\,\text{min}^{-1}$$

Enhetskonvertering til s⁻¹:

$$200\,\text{min}^{-1} \cdot \frac{1\,\text{min}}{60\,\text{s}} = 3{,}3\,\text{s}^{-1}$$

Svar: $k_{\text{cat}} = 3{,}3\,\text{s}^{-1}$ (to gjeldende siffer).

Merk at µmol/L forkortes bort i deloppgave c), slik at det som står igjen, er en ren invers tidsenhet. Det er nettopp slik det skal være: $k_{\text{cat}}$ er et antall omsetninger per tid, ikke en konsentrasjon.

---

Slik ville sensor telt momentene (7 vekttall):

- Må-punkter: enhetskonverteringen fra mM til M vist som eget ledd; begge effektivitetene riktig regnet med enhet; riktig konklusjon i b).
- Pluss-punkter: begrunnelsen i b) om at «raskest» og «mest effektivt» ikke er det samme; enhetskonverteringen fra min⁻¹ til s⁻¹ i c); at konsentrasjonsenheten forkortes bort.
- Feller: å regne med Km i mM og oppgi svaret i M⁻¹s⁻¹ — det gir svar som er tusen ganger for små; å konkludere med enzym B fordi $k_{\text{cat}}$ er høyest; felle E22 — å gjøre enhetskonverteringen i hodet i stedet for å skrive den som eget ledd. Enhetskonvertering er poenggivende i blokk 2, og det er et av de få stedene der du får betalt for å skrive ut noe du allerede har gjort.