6.3 PCR og gensekvensering

Å mangedoble og lese livets kode

Under covid-19-pandemien ble ett ord plutselig en del av dagligtalen: PCR. Men hva er det egentlig? Og hvordan kan forskere lese den nøyaktige rekkefølgen av baser i et DNA-molekyl?

Evnen til å kopiere og lese DNA er helt grunnleggende i moderne biologi og medisin. PCR (Polymerase Chain Reaction) lar oss lage milliarder av kopier av en bestemt DNA-sekvens på bare noen timer, mens gensekvensering avslører den nøyaktige basesekvensen. Disse teknologiene brukes i alt fra kriminalteknikk og diagnostikk til evolusjonsforskning. I dette kapittelet skal vi forstå hvordan PCR kopierer DNA eksponentielt, hvordan vi separerer og leser fragmentene, og hvordan moderne sekvensering har gjort det mulig å lese et helt genom på et døgn.

Kopimaskinen som dobler og dobler

PCR ble utviklet av Kary Mullis i 1983, et arbeid som ga ham Nobelprisen i 1993. Metoden mangedobler en bestemt DNA-sekvens in vitro -- altså i et reagensrør.

Du trenger noen ingredienser: templat-DNA (prøven), to primere (korte syntetiske DNA-biter som binder til hver sin ende av målsekvensen), Taq-polymerase, frie nukleotider (dNTPer) og en buffer med $Mg^{2+}$-ioner. Hver PCR-syklus har tre temperatursteg. Under denaturering (94--98 °C) skilles det dobbelttrådede DNA-et i to enkelttråder. Under annealing (50--65 °C) binder primerne til sine komplementære sekvenser. Under elongering (72 °C) syntetiserer Taq-polymerase nye tråder ved å forlenge primerne.

Hvorfor Taq-polymerase? Fordi den tåler de høye temperaturene. Vanlig DNA-polymerase ville blitt denaturert ved 94--98 °C, men Taq stammer fra bakterien Thermus aquaticus som lever i varme kilder, og er derfor varmestabil.

Det geniale er den eksponentielle veksten. En PCR-maskin (termosykler) veksler automatisk mellom de tre temperaturene, og etter $n$ sykler er antall kopier $N = 2^n$. Etter 10 sykler har du rundt 1000 kopier, etter 20 rundt en million, etter 30 rundt en milliard. Et eksempel: starter du med 100 kopier og kjører 25 sykler, får du $N = 100 \cdot 2^{25} = 100 \cdot 33\,554\,432 \approx 3{,}36$ milliarder kopier. Typisk kjører man 25--35 sykler på 1--3 timer.

Når PCR møter RNA, og separasjon etter størrelse

Standard PCR kopierer DNA, men noen ganger trenger vi varianter. RT-PCR (Reverse Transcription PCR) kombinerer revers transkripsjon med PCR for å amplifisere RNA: først isoleres RNA, revers transkriptase lager en cDNA-kopi, og cDNA-et brukes som templat i vanlig PCR. Det lar oss studere genuttrykk -- hvilke gener som er «påslått». qPCR (kvantitativ, eller real-time PCR) gjør det mulig å måle mengden DNA i sanntid: en fluorescerende reporter binder til det amplifiserte DNA-et, og fluorescensen måles underveis. Ct-verdien (cycle threshold) angir hvor mye utgangsmateriale som var til stede -- lavere Ct betyr mer.

Nettopp RT-qPCR ble brukt til å påvise SARS-CoV-2 under pandemien. Viruset har et RNA-genom, men PCR amplifiserer bare DNA. Derfor måtte virus-RNA først omskrives til cDNA med revers transkriptase, og deretter amplifiseres og kvantifiseres med qPCR.

Når vi har kopiert DNA, vil vi ofte separere fragmenter etter størrelse. Det gjør gelelektroforese. Metoden utnytter at DNA er negativt ladet (på grunn av fosfatgruppene) og derfor vandrer mot den positive polen (anoden) i et elektrisk felt. DNA-prøver lastes i brønner i en agarosegel, og et elektrisk felt drives gjennom. Gelen virker som et molekylært filter: små fragmenter beveger seg raskere gjennom maskestrukturen enn store. DNA-et farges (f.eks. med etidiumbromid) og synliggjøres under UV-lys, og en størrelsesmarkør kjøres i parallell. Slik kan vi sjekke om PCR ga riktig produkt, eller kartlegge restriksjonskutt.

Å lese bokstav for bokstav

Å kopiere DNA er én ting -- å lese den nøyaktige rekkefølgen er en annen. Den første store metoden var Sanger-sekvensering, utviklet av Frederick Sanger i 1977 og brukt til å sekvensere det humane genomet (Human Genome Project, 1990--2003).

Geniet ligger i bruken av dideoksyribonukleotider (ddNTPer). Vanlige nukleotider (dNTPer) har en 3'-OH-gruppe som DNA-polymerase bruker til å legge til neste nukleotid. ddNTPer mangler denne 3'-OH-gruppen -- så når et ddNTP inkorporeres, stopper kjeden. Hver av de fire ddNTPene er merket med ulik fluorescerende farge. I reaksjonen blandes templat, primer, polymerase, dNTPer og en liten mengde fluorescensmerkede ddNTPer. Tilfeldig inkorporering av ddNTPer stopper syntesen på ulike steder, slik at man får fragmenter av alle mulige lengder, hver med et fargemerket ddNTP på enden. Fragmentene separeres med kapillærelektroforese, og en laser leser fargerekkefølgen -- som gir sekvensen. Sanger kan lese opptil rundt 1000 baser per reaksjon.

Men Sanger er langsom og dyr for store genomer. Neste generasjons sekvensering (NGS) kan lese millioner av fragmenter parallelt. Den vanligste plattformen er Illumina, basert på «sekvensering ved syntese»: DNA kuttes i korte fragmenter, festes til en flowcelle og amplifiseres lokalt, og i hvert steg tilsettes fluorescensmerkede nukleotider med reversibel blokkering -- ett om gangen, fotografert mellom hvert steg. Forskjellen er enorm: Sanger leser faktisk lengre sekvenser per reaksjon (rundt 1000 bp mot 150--300 bp for Illumina), men NGS gjør millioner samtidig. Der Human Genome Project tok 13 år og kostet milliarder, kan et helt genom i dag sekvenseres for under 1000 dollar på et døgn.

Oppsummering

Vi har sett hvordan vi mangedobler og leser DNA. PCR kopierer en sekvens eksponentielt gjennom tre temperatursteg per syklus -- denaturering (94--98 °C), annealing (50--65 °C) og elongering (72 °C) -- med varmestabil Taq-polymerase, og gir $2^n$ kopier etter $n$ sykler. RT-PCR amplifiserer RNA via cDNA, og qPCR kvantifiserer i sanntid, slik RT-qPCR ble brukt mot SARS-CoV-2.

Gelelektroforese separerer DNA-fragmenter etter størrelse i et elektrisk felt, der små fragmenter vandrer raskest. Sanger-sekvensering bruker ddNTPer som stopper syntesen, og leser opptil 1000 baser. NGS (Illumina) sekvenserer millioner av fragmenter parallelt og har gjort helgenomsekvensering rask og rimelig.