6.1 Genteknologiske verktøy

Å redigere livets kode

Forestill deg at DNA er en uendelig lang tekst, og at du vil klippe ut akkurat ett ord, kopiere det milliarder av ganger og lime det inn i en annen tekst. Det høres umulig ut -- men nettopp dette gjør genteknologien mulig.

Genteknologi er samlebegrepet for metoder som lar oss isolere, analysere og manipulere DNA. De grunnleggende verktøyene -- restriksjonsenzymer, ligaser og vektorer -- har revolusjonert biologisk forskning og gjort det mulig å studere enkeltgener i detalj. De danner basisen for alt fra medisinsk diagnostikk til produksjon av legemidler. I dette kapittelet skal vi bli kjent med verktøykassen: saksene som klipper, limet som binder, transportmidlene som frakter DNA inn i celler, og bibliotekene som lagrer hele genomer.

Molekylære sakser og molekylært lim

For å redigere DNA trenger vi først en saks. Restriksjonsenzymer (restriksjonsendonukleaser) er enzymer som gjenkjenner en bestemt DNA-sekvens og klipper dobbelttrådet DNA på akkurat det stedet. De ble oppdaget i bakterier, der de fungerer som et forsvar mot fremmed DNA fra bakteriofager.

Hvert enzym gjenkjenner en bestemt sekvens på 4--8 basepar, ofte et palindrom som leses likt på begge tråder i 5'→3'-retning. Enzymet EcoRI gjenkjenner for eksempel GAATTC. Det avgjørende er hvordan de klipper. Klebrige ender (sticky ends) oppstår når enzymet klipper forskjøvet på de to trådene, slik at det dannes enkelttrådede overheng som kan basepare med komplementære ender. Dette er gull verdt i kloning, fordi alle fragmenter kuttet med samme enzym har identiske klebrige ender og lett binder til hverandre. Butte ender (blunt ends) oppstår når enzymet klipper rett gjennom begge tråder på samme sted -- ingen overheng, og dermed mindre effektive i kloning.

Nå trenger vi limet. DNA-ligase er enzymet som kobler sammen DNA-fragmenter ved å danne fosfodiesterbindinger mellom 3'-OH-gruppen på det ene fragmentet og 5'-fosfatgruppen på det neste. I laboratoriet bruker vi typisk T4 DNA-ligase. Den brukes til å koble fragmenter med klebrige ender (effektivt) eller butte ender (mulig, men mindre effektivt), og fremfor alt til å sette inn et genfragment i en vektor. DNA-ligase krever energi i form av ATP.

Transportmidler og kopimaskiner

Nå som vi kan klippe og lime, trenger vi en måte å frakte DNA inn i en celle der det kan kopieres. Det er jobben til en vektor -- et DNA-molekyl som bærer et fremmedgen inn i en vertscelle. En god vektor må ha tre ting: en replikasjonsopprinnelse (ori) så den kan kopieres, en seleksjonsmarkør (typisk et antibiotikaresistensgen) så vi kan finne cellene som har tatt den opp, og en multippel kloningsregion (MCS) med mange kuttesteder der fremmedgenet settes inn.

Det finnes flere typer vektorer. Plasmider er små, sirkulære DNA-molekyler (2--10 kb) som forekommer naturlig i bakterier; de er de vanligste vektorene og tar innsatser på opptil 15 kb. Virale vektorer bygger på modifiserte virus og kan ta større fragmenter -- mye brukt i genterapi. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) bygger på bakteriens F-plasmid og kan ta svært store innsatser (100--300 kb), viktig i genomprosjekter.

Men å sette inn ett gen er ikke nok -- vi vil ha mange kopier. Det er molekylær kloning: vi setter et DNA-fragment inn i en vektor og formerer det i en vertscelle. Først skjer transformasjon, der bakterien tar opp fremmed DNA. Det gjøres enten med varmesjokk (bakterier behandles med kalsiumklorid for å gjøre membranen permeabel, deretter et kort varmesjokk på 42 °C) eller elektroporering (korte elektriske pulser lager midlertidige porer i membranen). Elektroporering er mest effektiv, men varmesjokk er enklere. Etterpå selekterer vi: bakteriene dyrkes på medium med antibiotikum, slik at bare de som har tatt opp plasmiden med resistensgenet overlever. Til slutt screener vi for å finne hvilke kolonier som faktisk har plasmid med innsatt gen -- for eksempel med blå/hvit-screening eller koloni-PCR.

Biblioteker av gener

Noen ganger vil vi ikke bare ha ett gen, men en samling som dekker hele arvestoffet. Det kalles et genbibliotek -- en samling kloner som til sammen inneholder hele genomet til en organisme. Det finnes to hovedtyper, og forskjellen mellom dem er viktig.

Et genomisk bibliotek lages ved å kutte hele genomet med restriksjonsenzymer, sette hvert fragment inn i en vektor, og transformere dem inn i bakterier. Hver koloni inneholder da ett genomfragment. Dette biblioteket inneholder alt -- inkludert introner, reguleringssekvenser og repetitive sekvenser. For menneskegenomet kreves mange tusen kloner.

Et cDNA-bibliotek tar utgangspunkt i mRNA isolert fra en bestemt celletype. mRNA-et konverteres til komplementært DNA (cDNA) ved hjelp av enzymet revers transkriptase. Prosessen: en oligo(dT)-primer binder til mRNA-ets poly-A-hale, revers transkriptase lager den første DNA-tråden, mRNA fjernes, og DNA-polymerase lager den andre tråden. Det doble cDNA-et settes så inn i en vektor.

Forskjellen er avgjørende: et cDNA-bibliotek mangler introner. Hvorfor? Fordi cDNA lages fra ferdig prosessert mRNA, der intronene allerede er spleiset bort i cellekjernen. Dermed representerer et cDNA-bibliotek bare de genene som faktisk er uttrykt i den aktuelle celletypen -- noe som er svært nyttig når man for eksempel vil klone et humant gen i bakterier, som ikke kan spleise ut introner selv.

Oppsummering

Vi har gått gjennom genteknologiens verktøykasse. Restriksjonsenzymer gjenkjenner palindrome sekvenser og klipper DNA i klebrige eller butte ender, der klebrige ender letter kloning. DNA-ligase (T4) limer fragmenter sammen ved å danne fosfodiesterbindinger, og krever ATP.

Vektorer -- plasmider, virale vektorer og BAC -- frakter DNA inn i celler og må ha ori, seleksjonsmarkør og MCS. Kloning skjer ved transformasjon (varmesjokk eller elektroporering), seleksjon med antibiotika, og screening. Til slutt lagrer genbiblioteker arvestoffet: genomiske bibliotek dekker hele genomet inkludert introner, mens cDNA-bibliotek lages fra mRNA via revers transkriptase og bare inneholder uttrykte gener uten introner.